Analyse de séquençage
Contrôle qualité des ARNs
Un élément essentiel pour la réalisation de l’analyse de RNA-seq consiste à utiliser un matériel de départ de qualité. L’intégrité des ARNs est donc établie préalablement à la réalisation des librairies de séquençage. En effet, l’objectif est que les résultats du séquençage reflètent les différences biologiques observées et non des artefacts liés à une dégradation des ARNs. Afin de s’assurer de la qualité des ARNs destinés à être utilisés pour le RNA seq, ceux-si sont généralement caractérisés au moyen d’une analyse d’électrophorèse en microcapilaire (e.g. 2100 Agilent BioAnalyzer).
Les résultats de cette électrophorèse sont analysés au moyen d’un algorithme qui établit un score pour chacun des échantillons, sur une échelle de 1 à 10. Celui-ci, appelé RIN (RNA Integrity Number), est basé sur l’analyse des pics obtenus pour les ARNs les plus abondants dans les cellules : les ARNr 28S, 18S et 5S. Les pics correspondants à chacun de ces ARNr sont comparés au bruit de fond et aux bandes de dégradation afin de calculer un score (Figures from the Agilent website):
Voici des exemples correspondants à différents scores RIN :
Attention, cependant, car les ARN chloroplastiques influencent les résultats de l’analyse. Même si certaines adaptations algorithmiques peuvent être apportées, les résultats ne sont en général pas satisfaisants pour les parties aériennes des végétaux. Cependant, une inspection minutieuse des résultats de l’électrophorèse permet de vérifier l’absence de dégradation des ARN extraits. Des informations complémentaires peuvent être trouvées dans un article disponible dans l’onglet “Downloads”.
Préparation des librairies et séquençage
Une fois la qualité des ARNs vérifiée, ceux-ci sont fragmentés et utilisés afin de créer une librairie destinée à être séquencée. Dans le cadre de cette étude, c’est la technologie de séquençage Illumina qui a été employée. Voici les informations relatives au séquençage réalisé (extrait du Matériel et Méthodes de l’article scientifique dont le PDF est disponible au point 1- Dataset démo):
Libraries for RNA-Seq were prepared from 1 µg of total RNAs with the TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, https://www.illumina.com), multiplexed and sequenced in two runs with an Illumina NextSeq500 device (high-throughput mode, 75 base single-end reads) at the GIGA-R Sequencing platform (University of Liège), yielding on average approximately 22 million reads per sample.
La méthode de séquençage Illumina vous est rappelée dans la vidéo suivante :