Dessin d'amorce pour la validation par RT-qPCR
Validation de l’analyse de RNA-seq
Sélection des gènes candidats
Sur bases des analyses réalisées précédemment, il est nécessaire de choisir un petit nombre de gènes (5 à 10) pour lesquels les différences d’expression observées par RNA-seq seront validées au moyen d’une autre méthode, généralement la RT-qPCR, au sein d’une expérience indépendante.
Dessin d’amorces de qPCR
Une fois ces gènes sélectionnés, il est nécessaire d’obtenir des amorces permettant la quantification de leurs transcrits. Pour cela, deux stratégies sont possibles : soit utiliser des amorces provenant de publications (et donc déjà validées), soit dessiner des amorces de novo au moyen d’outils adéquats.
Dans le premier cas, il faut être attentif au fait que les amorces ont effectivement été utilisées afin d’amplifier le transcrit d’intérêt par RT-qPCR. En effet, les amorces utilisées pour de la PCR semi-quantitative amplifient des régions plus grandes (400 à 1000 pb = meilleure visualisation sur gel d’électrophorèse) et ceux de RT-qPCR amplifient des fragments plus petits (75 à 150 pb = meilleure efficacité).
Dans le second cas, la stratégie la plus couramment utilisée est la suivante :
- Obtenir la séquence du cDNA d’intérêt sur base de l’identifiant du gène (e.g. que cela soit sur TAIR, le site du NCBI, ou bien Phytozome) ;
- Utiliser cette séquence afin de dessiner des amorces permettant d’amplifier une région de 75 à 175 pb ;
- Vérifier la spécificité de la réaction (i.e. que les amorces n’amplifieront rien d’autre que la séquence d’intérêt).
Les étapes 2 et 3 sont toutes les deux intégrées à l’outil “Primer Blast” développé par le NCBI : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/. Celui-ci permet, pour la plupart des organismes séquencés, de dessiner des amorces spécifiques du gène ciblé. Au cours de ces séances de TPs, vous serez amenés à utiliser cet outil afin de dessiner des amorces pour une sélection de gènes candidats.
Voici les paramètres généralement utilisés pour le dessin d’amorces destinées à la RT-qPCR :
