Programme de la journée de mardi
1. Objectifs des manipulations
Le but de l’expérience va consister à réaliser un génotypage d’individus afin d’identifier ceux portant une mutation à l’état homozygote. Pour cela, nous allons réaliser, durant l’après-midi de mardi, une extraction d’ADN génomique qui sera suivie d’une amplification par PCR. Les résultats de cette PCR seront visualisés le mercredi en début d’après-midi via un gel d’agarose.
Votre objectif consiste à déterminer les génotypes à un locus donné d’individus dont vous allez extraire l’ADN. Il est essentiel de comprendre chacune des étapes que vous allez réaliser.
2. Principe de l’expérience
En biologie, l’étude de la fonction des gènes passe souvent par la génération de mutations aléatoires. Une fois qu’une mutation conduisant à un phénotype intéressant a été identifiée, il existe de nombreux moyens de la caractériser. Une des techniques les plus couramment utilisées consiste à utiliser des gènes rapporteurs, dans lesquels un marqueur fluorescent (e.g. GFP, RFP, YFP,…) est placé sous la dépendance d’un promoteur inductible.
Dans ce cas-ci, c’est la mutation pin3-4 que nous allons étudier. Pour étudier l’effet de cette mutation sur le transport de l’auxine, il est par exemple possible d’employer le gène rapporteur DR5::GFP, dans lequel le gène codant pour la GFP est placé sous la dépendance d’un promoteur induit par la présence d’auxine.
Une façon d’insérer ce gène rapporteur dans le double mutant consiste à réaliser des croisements entre un mutant pin3-4 -/- (= homozygote) et une lignée exprimant la construction DR5::GFP à l’état homozygote. Suite à ce premier croisement, les individus de la F1 auront tous le génotype suivant (= double hétérozygote) :
F1 = pin3-4 +/- et DR5::GFP +/-
Chez Arabidopsis thaliana, l’obtention d’individus homozygotes pour deux caractères requiert l’autofertilisation des F1, conduisant à une F2 qui sera composée à 1/16ème d’individus doubles homozygotes : 1/4 de pin3-4 homozygote X 1/4 de DR5::GUS homozygotes. Au cours de cette séance de TP, c’est avec cette F2 que nous travaillerons. Nous allons tenter d’identifier les individus homozygotes pour la mutation pin3-4 via la réalisation d’une PCR qui produira des amplicons de tailles différentes selon que la mutation est présente ou non. Cette analyse nécessitera la réalisation des étapes suivantes :
- Extraction d’ADN ;
- Réalisation de la PCR ;
- Visualisation des produits de PCR sur un gel d’agarose.
