Le principe d’une PCR consiste à amplifier une portion déterminée d’ADN (ici, de l’ADN génomique) au moyen d’amorces spécifiques du gène qui nous intéresse. Dans ce cas-ci, la PCR aura pour but de discriminer les individus homozygotes mutants pin3-4 des hétérozygotes mutants pin3-4 et des plantes non mutées dans le gène PIN3. La mutation pin3-4 est le résultat de l’insertion d’une région T-DNA (voir explications au TP) au sein du gène PIN3, ce qui interrompt sa séquence et le rend dès lors non fonctionnel. Les amorces que vous utiliserez permettront d’obtenir des amplicons de tailles différentes selon que le T-DNA est présent ou non. Les produits de PCR seront ensuite visualisés sur un gel d’agarose en présence d’un produit (MIDORY Green) qui, une fois intercalé dans de l’ADN double brin et exposé à des UV, émet de la fluorescence. Des explications complémentaires vous seront fournies pendant la séance de TP.
A. Préparation du mélange réactionnel [en tube de 1,5 ml].
Pour 3 tubes (2 échantillons + blanc de PCR) :
| Réactif | Mix 1X (Vol tot = 19 µl) | Mix pour 3 tubes (avec excès) |
|---|---|---|
| Tampon 5 x | 4 µl | 14 µl |
| Amorce 1 (10 µM) | 0,4 µl | 1,4 µl |
| Amorce 2 (10 µM) | 0,4 µl | 1,4 µl |
| Amorce 3 (10 µM) | 0,4 µl | 1,4 µl |
| dNTPs (2 mM) | 2 µl | 7 µl |
| Eau stérile | 11,1 µl | 38,85 µl |
| DMSO | 0,6 µl | 2,1 µl |
| ADN polymérase (5U/µl) | 0,1 µl | 0,35 µl |
B. Vortexer légèrement le mélange et centrifuger (short spin)
C. Préparation des tubes PCR (2 tubes de 0,2 ml)
D. Programme PCR (réalisé « overnight ») : Les tubes annotés vont être placés dans un thermocycleur afin de réaliser la réaction de PCR. Celle-ci consistera en la réalisation du programme suivant :
1. 94°C pendant 3’ [= dénaturation initiale]
2. 94°C pendant 30’’ [= dénaturation] ;
3. 57°C pendant 30’’ [= hybridation] ;
4. 72°C pendant 1’15’’ [= élongation (1kb/min)] --> 39X retour à l'étape 2 (= 40 cycles).
5. 72°C pendant 10’ [ =élongation finale]
6. 10°C ∞
E. Visualisation des produits de PCR (le lendemain). Pour cela, nous avons d’ores et déjà mis à polymériser un gel d’agarose à 1% contenant 5µl/100ml de Midori Green (= agent intercalant permettant de visualiser l’ADN double brin). Il reste à ajouter les produits de PCR sur le gel et à réaliser l’électrophorèse. Pour cela :
F. Il reste maintenant à identifier les individus homozygotes pour la mutation pin3-4.
